Jabatan Pertahanan Amerika Syarikat ( Bahasa Inggeris : United States Department Of Defense ; singkatan : DOD dan USDOD ) merupakan sebuah jabatan persekutuan yang dipertanggungjawab untuk mengurus dan menyelia kesemua agensi dan fungsi kerajaan yang berkait rapat keselamatan negara dan Angkatan Tentera Amerika Syarikat, bersamaan dengan Kementerian Pertahanan di negara lain. Organisasi dan fungsi Jabatan Pertahanan A.S ada diterangkan di dalam Judul 10 di dalam Kanun Amerika Syarikat.Jabatan Pertahanan AS merupakan penyewa terbesar di Bangunan The Pentagon berhampiran Washington, DC. Jabatan ini terdiri daripada tiga komponen utama iaitu — Jabatan Tentera Darat Amerika Syarikat, Jabatan Tentera Laut Amerika Syarikat dan Jabatan Tentera Udara Amerika Syarikat.Agensi-agensi Jabatan Pertahanan yang lain adalah Agensi Pertahanan Peluru Berpandu, Agensi Projek Penyelidikan Pertahanan Termaju, Agensi Pasukan Perlindungan Pentagon, Agensi Perisikan Pertahanan, Agensi Perisikan Geospatial Negara dan Agensi Keselamatan Negara. Jabatan ini juga mengoperasikan beberapa sekolah-sekolah perkhidmatan bersama, termasuk Kolej Peperangan Negara.